Предистория

Постановление Правительства Российской Федерации от 22.02.2007 г. N 121 «О присуждении премий Правительства Российской Федерации 2006 года в области науки и техники»

Присудить премию Правительства Российской Федерации 2006 года в области науки и техники и присвоить звание «Лауреатов премии Правительства Российской Федерации в области науки и техники» коллективу авторов за конструирование бактериальных продуцентов, организацию биотехнологического производства субстанций и препаратов на основе рекомбинантных цитокинов человека и внедрение разработанного медицинского препарата Беталейкин®.

Чем интересна молекула ИЛ-1β

На фоне все более широкого применения иммуномодуляторов различных классов в современной медицинской практике, особый интерес специалистов привлекают цитокины.
Цитокинами называют эндогенные вещества с помощью которых клетки могут обмениваться друг с другом информацией и осуществлять координацию действий. Говоря иначе, цитокины действуют как апокринные или паракринные факторы, осуществляющие информационный обмен и, таким образом, во многом реализуют взаимодействие клеточных элементов на тканевом, органном и даже системном уровнях.

Со второй половины прошлого столетия обнаружено более сотни таких «локальных гормонов» - это низкомолекулярные пептиды, которые секретируются неэндокринными клетками локально и непостоянно.

Биологическая активность цитокинов проявляется в пикомолярных концентрациях через взаимодействие со специфическими рецепторами. Существенное значение имеет баланс самих цитокинов и их рецепторов, количество и качество которых меняется в зависимости от зрелости и функциональной активности клетки. Набор и количества (спектр) цитокинов и рецепторов различных типов клеток, представляют собой матрицу взаимодействующих и часто меняющихся сигналов. Важно подчеркнуть, что передаваемая информация содержится не в индивидуальном пептиде, а в целом наборе этих регуляторных молекул. Цитокины индуцируют синтез друг друга, модулируют соответствующие клеточные рецепторы, взаимодействуя как синергисты или антагонисты, в том числе с другими регуляторными молекулами, например, гормонами.

Эту систему регуляции жизнедеятельности как информационную систему часто называют «цитокиновая сеть», биологическим (биохимическим) выражением которой является «цитокиновая среда».

В иммунной системе важнейшую роль играют интерлейкины, интерфероны, фактор некроза опухоли и др. В настоящее время описано около 30 интерлейкинов (ИЛ), они регулируют такие процессы как пролиферация, дифференцировка, функциональная активность клеток иммунной системы и некоторых других клеточных линий.

Исторически первым был описан эндогенный пироген, названный впоследствии интерлейкин-1 (ИЛ-1). Такое первенство не случайно. В эволюционном плане ИЛ-1 считается одним из самых древних факторов, обеспечивающих реализацию защиты организма при разнообразных повреждающих воздействиях.

Основным источником продукции ИЛ-1 являются фагоцитирующие мононуклеары различной тканевой локализации: макрофаги и моноциты периферической крови и перитонеального экссудата, купферовские клетки печени, клетки Лангерганса в эпидермисе, клетки микроглиии нервной ткани. Активными продуцентами ИЛ-1 являются также эндотелиоциты. Кроме того, способностью секретировать данный цитокин обладают Т-лимфоциты и В-лимфоциты, фибробласты, НК-клетки, кератиноциты, нейтрофилы. В интактном состоянии эти клетки не продуцируют ИЛ-1 и не содержат его мРНК. Экспрессия гена ИЛ-1 с образованием биологически активного белка начинается только после активации клеток. Стимуляторами синтеза являются эндотоксин грамотрицательных бактерий, грамположительные бактерии, стимуляторы фагоцитоза (зимозан-продукт клеточных стенок простейших; частицы кремния; латекс), вирусы, иммунные комплексы, УФ-облучение и другие индукторы воспаления. Подавляется секреция ИЛ-1 глюкокортикоидами и некоторыми простагландинами.

Одно из наиболее существенных свойств ИЛ-1 - это стимуляция пролиферации, хотя сам по себе ИЛ-1 не является фактором роста, его эффект обусловлен индукцией выработки эндогенных колониестимулирующих факторов и синергичным с ними усилением пролиферации и дифференцировки клеток различных ростков. ИЛ-1 действует на кроветворные клетки на разных этапах их созревания, включая стадию полипотентных стволовых клеток. Поэтому применение «Беталейкина» приводит к возрастанию не только количества гранулоцитов, но также тромбоцитов и лимфоцитов.

ИЛ-1 обладает ярко выраженным иммуностимулирующим действием, связанным с увеличением функциональной активности лимфоцитов и нейтрофильных лейкоцитов. Одним из важных механизмов реализации его действия является взаимодействие с иммунными комплексами.

Однако ИЛ-1 является регулятором не только специфических (иммунологических), но и неспецифических защитных реакций организма. К последним относят воспаление и стресс.

ИЛ-1 является также одним из важнейших регуляторов воспаления. Именно ИЛ-1 индуцирует «острофазовые реакции» - лихорадку, лейкоцитоз, продукцию и секрецию острофазных белков, экспрессию интегринов, хемотаксис гранулоцитов. ИЛ-1 оказывается вовлечен во все этапы нормального воспаления, вплоть до стимуляции посттравматической регенерации тканей.

Участие ИЛ-1 в реализации стресс-реакции обусловлено в значительной степени его влиянием на уровень глюкокортикоидов и центральные структуры мозга. Интересно, что данный цитокин способен предотвращать развитие иммуносупрессии, вызванной стрессом и глюкокортикоидными гормонами. В литературе существует и множество других данных, позволяющих считать ИЛ-1 медиатором нейроиммунных взаимодействий.

В последние годы уделяется внимание ИЛ-1 как системному регулятору остеогенеза. Он активирует костномозговую продукцию остеокластов и их функциональную активность, в частности - стимулирует остеокластическую резорбцию. С другой стороны, ИЛ-1 стимулирует пролиферацию остеобластов и их дифференцировку в остеоциты, а возможно и изменяет продукцию гликозоаминогликанов. Таким образом, ИЛ-1 активно вмешивается в регуляцию состояния костной ткани, воздействуя на различные ее клеточные системы (остеокласты и остеобласты). Таким образом, ИЛ-1 является ключевым медиатором многих защитных реакций организма.

Наличие у ИЛ-1 вышеперечисленных качеств обосновало создание медицинского препарата «Беталейкин»®, который является лекарственной формой рекомбинантного ИЛ-1β человека.

На настоящий момент «Беталейкин» является единственным рекомбинантным препаратом ИЛ-1β, разрешенным к применению в лечебной практике на территории РФ. Препарат полностью соответствует природному аналогу по биохимическим характеристикам и по биологическому действию.

Все вышесказанное позволяет нам с гордостью называть «Беталейкин»® бриллиантом иммунотерапии, который действительно отшлифован миллионами лет эволюции, а терапию «Беталейкином» определить как заместительную цитокинотерапию.

Литература

  1. Базарный В.А., Левчик Н.К., Кохан М.М. и др. Определение содержания интерлейкина-1 в биологических жидкостях//Клин. лаборат. диагностика.-1999.-№ 11.-С.28.
  2. Бубнова Л.Н., Глазанова Т.В., .Зубарева Т.С. и др. Характеристика иммунокомпетентных клеток при некоторых органоспецифических аутоиммунных заболеваниях//Мед.иммунология.- 1999.-№ 3-4.-С.50-51.
  3. Кетлинский С.С. , Симбирцев А.С. Цитокины Издательство: Фолиант, 2008.,- 552с.
  4. Кетлинский С.С. , Симбирцев А.С., Воробьев А.А. Эндогенные иммуномодуляторы.-СПб.: Гиппократ, 1992.-256с.
  5. Kорнева Е.А., Рыбакина Е.Г., Фомичева Е.Е и др. Иммуномодулирующие эффекты ИЛ-1 и глюкокортикоидных гормонов как взаимодействующих звеньев в нейроиммунорегуляторной 4enn//lnternat.J.lmmunorehabilit.-1998.-N 10.-Р.38-48.
  6. Фрейдлин И.С., Кузнецова С.А. Иммунные комплексы и цитокины//Мед.радиология.-1999.-№ 1-2.-С.27-36.
  7. Dinarello C.A. Clinical relevance of interleukin-1 and its multiple biological activities// Bull.lnst.Pasteur.- 1987.-N 3.- P.267-285.
  8. Fleisch H., Felix R.,Guenther H.et al. Differentiation and function of osteoblasts. and bone cell derived cytokines // Progr.Endocrinol.-Amsterdam, 1988.-Vol.2.-P. 915-920.
  9. Hogoust K.A., Chaplin D.D. lnterleukin-1 (IL-1) release from monocyte cells stimulated with lipopoly-sacharide//J.Cell Biol.-1990.- Vol.111.- P.464-465.
  10. Paul W.E., Kishimoto T., Melcharist F.et al. Nomenclature for secreted regulatory proteins of the immune system (interleukins)//Clin.Exp. lmmunol.-1992.-Vol.88.- P.367.
  11. Rooney M., Symons J.A., Duff G.W. Interleukin-1 in synovial fluid is related to local disease activity in rheumatoid artritis//Rheumatol.lnt.-1990.-N 10.-P.217-219.
  12. Thomson A.W. The Cytokine Handbook.-Academic Press: London, 1994.- 615 p.
  13. Wood N.C., Dickens E., Symons J.A.In situ hybridization of interleukin-1 in CD14-positive cells in rheumatoid arthritis//Clin.lmmunol. Immunopathol. -1992. -Vol. 62.-P.295-300.

История создания «Беталейкина»

Работа по получению ИЛ-1β человека была начата с попыток его выделения из донорской крови, но получаемые количества были ничтожно малы и не могли быть использованы для дальнейшей работы. В связи с этим, в 1985-1987 гг. были развернуты исследования по созданию рекомбинантного ИЛ-1β, который должен был быть получен с использованием генно-инженерной технологии. Для достижения этой цели были согласованы совместные работы ГосНИИ ОЧБ (Санкт-Петербург) с ГосНИИ генетика (Москва).

В 1988-89 гг. были начаты работы непосредственно по молекулярному клонированию гена ИЛ-1β. На первом этапе усилиями лабораторий ГосНИИ ОЧБ отрабатывали условия культивирования и индукции моноцитов донорской крови человека, выбирали наиболее активный индуктор ИЛ-1β и определяли оптимальные сроки для получения мРНК, которая затем в Институте генетики была использована для получения кДНК. Было осуществлено молекулярное клонирование полноразмерного гена про-интерлейкина-1β из библиотеки кДНК, созданной на основе мРНК из клеток крови человека (Котенко и др., 1989). При клонировании была получена библиотека из 2,3x106 независимых клонов, доля рекомбинантов в которой составила 80%.

Клонированная последовательность кДНК кодировала структуру про-ИЛ-1β, в точности соответствующую известной к тому времени, и потому соответствующий фрагмент ДНК мог быть использован для создания на его основе штамма бактерий, продуцирующих функционально активный рекомбинантный ИЛ-1β, не отличающийся по структуре от его природного аналога.

Одним из ключевых моментов цикла работ по созданию препарата «Беталейкин» явилось получение рекомбинантного штамма – продуцента интерлейкина-1β, пригодного для промышленного производства. Эта работа была выполнена, был синтезирован полипептид и последующее определение биологической активности выделенного белкового продукта доказало, что синтезируемый полипептид является ИЛ-1β.

Полученный препарат рИЛ-1β обладал дозозависимым биологическим действием в тесте костимуляции пролиферации тимоцитов мыши, с удельной активностью 108 ед/мг белка. Данное значение удельной биологической активности находится в соответствии с результатами определения удельной биологической активности высокоочищенных природных и рекомбинантных препаратов ИЛ-1 по данным разных авторов. Сравнительный анализ биологического действия рИЛ-1β и природных препаратов ИЛ-1β показал, что способность рИЛ-1β активировать пролиферацию лимфоцитов не отличается от лимфоцитактивирующего действия природного препарата ИЛ-1β человека (Simbirtsev et al., 1991). В дальнейшем было продемонстрировано, что и при введении in vivo лабораторным животным рекомбинантный ИЛ-1β при прямом сравнении с высокоочищенным природным ИЛ-1β не отличается от него по биологической активности (Лесников В.А. и др., 1993). Таким образом, как по биохимическим характеристикам, так и по биологическому действию полученный препарат рИЛ-1β полностью соответствовал природному аналогу.

Далее в ГосНИИОЧБ развивается технология промышленного культивирования штамма-продуцента, технология очистки с применением оригинальных сорбентов и методов хроматографии, а также методы анализа целевого продукта - ИЛ-1β. Согласно требованиям, предъявляемым ВОЗ к оценке свойств рекомбинантных белков, были разработаны десятки методов, большинство из которых были применены впервые. В ходе этих работ чистота и качество ИЛ-1β оценивалось с использованием методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), N- и С-концевого секвенирования аминокислот, иммуноблотинга, определения изоэлектрической точки (pI), пептидного картирования и т.д. В ГосНИИ ОЧБ строится цех, в котором разворачивается опытно-промышленное производство препарата Беталейкин.

Субстанция рекомбинантного интерлейкина-1β и лекарственный препарат Беталейкин были подвергнуты токсикологическому исследованию, которое выявило безвредность препарата при использовании их в определенном интервале доз (ВИЛАР).

Помимо клинических работ следует отметить экспериментальные исследования в различных моделях на животных. Особенно интересными оказались работы по радиобиологическим свойствам ИЛ-1β, проведенные в институте биофизики, Военно-медицинской академии и институте военной медицины.

Анализ научно-технической документации по «Беталейкину», проведенный сотрудниками ГИСК им. Тарасевича, привел в 1995 г. к разрешению провести клинические испытания 1 и 2 фаз в Институте онкологии им. акад. Н.Н. Петрова МЗ РФ, Всероссийском научном онкологическом центре РАМН (ВОНЦ) и Институте биофизики МЗ РФ. В целом было показано, что в дозах 15-20 нг на кг веса человека «Беталейкин» представляет собой эффективное средство в лечении осложнений, возникающих при применении химио- и радиотерапии опухолей у онкологических пациентов. Было выявлено, что 3-кратная инъекция препарата способствует преодолению нейтропении, а после 5–ти кратного введения полностью восстанавливается кроветворение, что дает возможность врачам-онкологам проводить дальнейшую терапию (Гершанович М. и др).

Одним из важнейших этапов в применении «Беталейкина» явилась разработка схемы введения препарата, при использовании которой был выявлено протекторное действие препарата на сохранение костного-мозгового кроветворения в процессе продолжающейся цитостатической терапии (Гершанович М.). В процессе клинических испытаний и после их окончания, удалось показать, что замена внутривенного введения препарата на подкожное, при незначительном увеличении дозы, дает одинаковывые результаты при меньшей травматизации (Филатова Л.).

Проведенный мониторинг иммунного статуса пациентов, получивших курс лечения препаратом, выявил, что «Беталейкин» вызывает стимуляцию иммунной системы (Личиницер Р.). Существенным продвижением в понимании механизма действия препарата явилось его способность увеличивать мобилизацию стволовых клеток в периферическую кровь (Баранов Е., Кончаловский М.).

В 1997 году Минздрав выпускает приказ о широком клиническом применении препарата «Беталейкин». В настоящее время проводятся испытания препарата «Беталейкин» в других направлениях медицинской практики.