Сравнительные результаты использования препаратов рекомбинантного интерлейкина-1β и рекомбинантного интерферона-α2b в терапии больных хроническим вирусным гепатитом С.

Н.И.Кузнецов, В.И. Кабанова
ГОУДПО «Санкт-Петербургская Медицинская Академия Последипломного Образования МЗ РФ»
В.Г.Конусова, А.В.Жахов, А.С.Симбирцев
ФГУП Государственный НИИ особо чистых биопрепаратов ФМБА России
А.В.Семенов
ГУЗ «Городской вирусологический консультативно-диагностический центр», Санкт-Петербург

Введение

За последние годы лечение хронического гепатита С (ХГС) существенно изменилось: от монотерапии интерфероном-α2b до комбинированной терапии пегилированным интерфероном в сочетании с рибавирином. Появление данной комбинированной формы терапии позволило повысить частоту устойчивого вирусного ответа при лечении пациентов ХГС до 60%. В настоящее время, исходя из концепции о роли недостаточности клеточного иммунного ответа в персистенции вируса, обсуждаются и изучаются возможности использования в терапии ХГС препаратов, нормализующих иммунный статус организма. Следует отметить, что при разработке новых методов терапии необходимо учитывать, что с точки зрения больных терапия ХГС является дорогостоящей и тяжелопереносимой процедурой [1]. Поэтому изучение новых более доступных дешевых средств противовирусной терапии ХГС является весьма актуальным.
Целью данной работы было изучения возможности использования в терапии ХГС рекомбинантного интерлейкина-1β (Беталейкин). ИЛ-1 стимулирует развитие целого комплекса защитных реакций, направленных на развитие местной воспалительной реакции, ограничение распространения инфекции, элиминацию внедрившихся микроорганизмов и восстановление целостности поврежденных тканей [2]. Кроме того, ИЛ-1бета обладает прямым ингибирующим действием на репликацию вируса HCV [3]. В настоящее время лекарственная форма ИЛ-1 бета - препарат Беталейкин разрешен Минздравом РФ к клиническому применению в качестве иммуностимулятора при вторичных иммунодефицитных состояниях, в том числе связанных с развитием инфекционных заболеваний.

Объект и методы исследования

Под наблюдением находился 31 пациент с диагнозом ХГС. Диагноз гепатита С был подтвержден обнаружением маркеров вируса гепатита C. В основном группа обследованных пациентов была представлена лицами мужского пола 61,2%, женщин – 38,8%. Средний возраст больных составлял 27,9 ± 3,2 лет. Клинические признаки вирусного гепатита у всех обследованных пациентов были слабо выражены. Повышение активности АЛТ было в 1,5–5 раз выше нормы. Длительность инфицирования в средним составляла 5,8 ± 1,2 года.
При морфологическом исследовании печени у 27 пациентов были выявлены различные степени выраженности фиброза: слабая – 6 пациентов (1 стадия), умеренная – 8 человек (2 стадия) и выраженная степень – 13 человек (3стадия). Степень активности патологического процесса в печени была умеренно выраженной (ИГА = 9-12 баллов по Кноделю).
Вирусная нагрузка определялась методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием тест-системы «АмплиСенс HCV- Монитор – FRT» производства ЦНИИЭМЗРФ (Россия) на приборе iCycler фирмы «BioRad» (США). Определение РНК HCV в лимфоцитах осуществлялось с помощью коммерческих тест систем «Ампли-Сенс HCV FRT». В основной группе обследованных вирусная нагрузка составляла более 106 копий/мл, при этом 1 генотип определялся у 11 человек, 2-3 генотип у 17 человек и у 3 пациентов генотип не определялся.
Беталейкин назначался пациентам в дозе 8 нг/кг массы тела в сутки, внутривенно капельно на 500 мл 5% раствора глюкозы. Курс составлял 10 инъекций. Препарат вводился через день. При введении препарата у больных отмечались: повышение температуры тела до субфебрильных цифр реже до фебрильных цифр, озноб, ломота в суставах. Эти проявления самостоятельно купировались в течение 4-5 часов после прекращения введения препарата. В редких случаях больные принимали нестероидные противовоспалительные препараты. Подобные побочные симптомы наблюдались, как правило, до второго введения препарата и повторялись на пятом и седьмом введениях препарата.
Группу сравнения составили 19 больных ХГС, получавших монотерапию ИФН-α2b (препарат Интераль производства ГосНИИ особо чистых биопрепаратов, С-Петербург) по стандартной схеме 3 млн. МЕ, 3 раза в неделю в течение 6 месяцев. По своим клинико-биохимическим, молекулярно-биологическим и морфологическим параметрам данные группы были сходны.
Процессы образования свободно-радикальных форм кислорода фагоцитирующими клетками периферической крови изучали с помощью метода люминолзависимой хемилюминесценции. Определяли уровень хемилюминесценции, индуцированной форболмиристатацетатом с помощью хемилюминометра LKB-1251 (Швеция). Данные выражали в mV за 30 мин наблюдения. Уровни цитокинов определяли с помощью иммуноферментных тест-систем производства ООО «Цитокин» (С-Петербург). В качестве индуктора синтеза цитокинов лейкоцитами цельной периферической крови использовали липополисахарид E.coli (ЛПС) в дозе 1 мкг/мл.

Результаты исследования и их обсуждение

В настоящее время общепринятым критерием оценки эффективности ответа на лечение является вирусологический ответ. Как известно при хронической инфекции уровень HCV РНК отражает степень репликации вируса и может быть использован для мониторирования эффективности противовирусной терапии [4]. Оценка терапевтической эффективности Беталейкина проводилась по двум показателям, а именно количественное определение РНК HCV в сыворотке крови и выявление РНК HCV в лимфоцитах (качественная реакция). Контрольные исследования РНК проводились через 1, 3, 6 и 12 месяцев после окончания терапии. В эти же сроки проводилось обследование и в группе сравнения. Положительным ответом на проведенную терапию считалось снижение вирусной нагрузки более, чем на 2 log и отрицательная качественная ПЦР на РНК HCV в лимфоцитах. Данные результатов определения РНК HCV приведены в таблице 1.

Таблица 1. Динамика уровня  РНК ВГС в сыворотке крови и лимфоцитах после терапии Беталейкином.

Как видно из представленной таблицы снижение вирусной нагрузки в сыворотке крови более чем на 2 log через месяц после окончания терапии отмечалось у 21 человека, и у 1 больного с не 1 генотипом ПЦР на РНК HCV была отрицательной. Через 3 месяца после окончания терапии Беталейкином число лиц положительно ответивших на терапию увеличилось, так у 26 (84%) больных наблюдалось снижение вирусной нагрузки более чем на 2 log и у 6 (19%) ПЦР на РНК HCV в сыворотке крови была отрицательной. Однако, следует отметить, что отрицательная ПЦР на РНК HCV через 1 или 3 месяца после окончания терапии Беталейкином не гарантировала устойчивый вирусологический ответ в более отдаленные сроки (через 6 и 12 месяцев) и, наоборот, при положительной ПЦР на РНК HCV в первые 3 месяца в отдаленном периоде она могла стать отрицательной.
Несмотря на колебания уровня вирусной нагрузки, в целом до 3 месяца после окончания курса лечения Беталейкином у всех 100% анализируемых больных наблюдался положительный вирусологический ответ (имеется ввиду, что уровень РНК HCV снижался по сравнению с исходным уровнем), при этом у 26 пациентов имело место снижение вирусной нагрузки более чем на 2 log, а у 6 (19,4%) ПЦР была отрицательной. После этого к концу года у 11 (34,5%) больных происходило дальнейшее снижение, у 18 (58,1%) пациентов имело место повышение уровня РНК HCV в сыворотке крови, а у 2 (6,4%) больных анализируемые показатели оставались на прежнем уровне. В итоге через 12 месяцев после терапии Беталейкином по сравнению с показателями на момент начала лечения у 28 (90,3%) был отмечен положительный вирусологический ответ по сыворотке крови, при этом у 23 (74,2%) больных наблюдалось снижение вирусной нагрузки более чем на 2 log, а у 4 (12,9%) пациентов ПЦР была отрицательной. Индивидуальные показатели динамики выявления РНК ВГС с помощью ПЦР в сыворотке крови больных при лечении Беталейкином приведены на рис.1 (больные с 1 генотипом) и рис. 2 (больные со 2 и 3 генотипом).

 
по оси ординат – вирусная нагрузка (количество копий РНК в виде логарифмической шкалы),
по оси абсцисс – сроки наблюдения.

Рис.1 Индивидуальные показатели динамики выявления РНК ВГС с помощью  ПЦР в сыворотке крови у больных с 1 генотипом при лечении Беталейкином (n=11).

по оси ординат – вирусная нагрузка (количество копий РНК в виде логарифмической шкалы),
по оси абсцисс – сроки наблюдения.

Рис.2 Индивидуальные показатели динамики выявления РНК ВГС с помощью ПЦР в сыворотке крови у больных с 2 и 3 генотипом при лечении Беталейкином (n=17).

 

При анализе результатов выявления РНК HCV в лимфоцитах на фоне терапии Беталейкином, представленных в таблице 1 видно, что они имеют сходную динамику с изменениями  динамики уровней РНК HCV в сыворотке крови. Через 3 месяца после окончания курса терапии Беталейкином, также как и в сыворотке крови происходило повышение количества положительных реакций на РНК HCV в лимфоцитов. В течение срока наблюдения отрицательная ПЦР на РНК HCV в лимфоцитах сохранялась у 14 (45,2%) пациентов. После окончания терапии Беталейкином через 1 год отрицательная ПЦР на РНК вируса гепатита С в лимфоцитах была у 21 (68%) больного. Индивидуальные показатели динамики выявления РНК ВГС с помощью ПЦР в лимфоцитах больных при лечении Беталейкином в зависимости от генотипа вируса приведены на рис. 3 и 4.

 

по оси ординат – изменения вирусной нагрузки в ходе терапии:
(+) – наличие РНК ВГС,
(±) - снижение вирусной нагрузки более чем на 2 log,
(-) отсутствие РНК ВГС,
по оси абсцисс – сроки наблюдения.

Рис.3 Индивидуальные показатели динамики выявления РНК ВГС с помощью ПЦР в лимфоцитах у больных с 1 генотипом HCV (n=11) при терапии беталейкином.

 

 

по оси ординат – изменения вирусной нагрузки в ходе терапии:
(+) – наличие РНК ВГС,
(±) - снижение вирусной нагрузки более чем на 2 log,
(-) отсутствие РНК ВГС,
по оси абсцисс – сроки наблюдения.

Рис.4 Индивидуальные показатели динамики выявления РНК ВГС с помощью  ПЦР в лимфоцитах у больных со 2 и 3 генотипами HCV (n=17) при терапии беталейкином.

При анализе корреляционных связей после окончания курса лечения через 12 месяцев была выявлена прямая корреляционная связь между уровнем РНК HCV в сыворотке крови, возрастом больных и длительностью заболевания, а также прямая корреляционная связь между уровнем РНК HCV в сыворотки крови и наличием РНК HCV в лимфоцитах. Достоверных отличий результатов лечения во все сроки исследования по уровню РНК HCV в сыворотке крови в зависимости от генотипа HCV выявлено не было. Следует отметить более благоприятную динамику результатов определения РНК HCV в лимфоцитах при 2 и 3 генотипа HCV. Однако достоверные отличия были выявлены только к 6 месяцу после окончания лечения.
Сопоставляя результаты лечения основной и сравнительных групп, которые представлены в таблице 2, видно, что в сравнительной группе после окончания 6 месячного курса терапии Интералем положительный вирусологический ответ по сыворотке крови достоверно выше при контрольном обследовании в 1, 3, и 6 месяцы после окончания терапии. К моменту обследования через год показатели устойчивого вирусологического ответа (УВО) по результатам исследования сыворотки крови в обеих группах практически становятся равными, причем в сравнительной группе частота УВО снижается в 2 раза. Такое снижение УВО в сравнительной группе вероятно связано с активацией внепеченочной репликации HCV, о чем свидетельствует уменьшение числа отрицательных результатов ПЦР на РНК HCV в лимфоцитах через год после окончания терапии, в то время как в основной группе эти показатели практически остаются без изменения, начиная с 3 месяца контрольного обследования.

Таблица 2. Динамика определения РНК HCV в сыворотке крови и лимфоцитах в основной и сравнительной группах на фоне проводимой терапии.

 

Изменения иммунологических показателей в ходе лечения Беталейкином свидетельствуют об активации защитных реакций в результате применения препарата. При исследовании состояния фагоцитарной системы оказалось, что показатели люминолзависимой хемилюминесценции лейкоцитов цельной крови у больных ХВГС до лечения были ниже, чем в контрольной группе. Проведенный курс терапии Беталейкином приводил к повышению данных показателей до уровня показателей здоровых доноров (табл.3). Во время курса терапии Беталейкином отмечалось повышение индуцированной ЛПС продукции лейкоцитами одного из основных провоспалительных цитокинов – интерлейкина-8, что говорит в пользу активирующего влияния препарата на функциональную активность фагоцитирующих клеток (табл.3).

Таблица 3. Изменения показателей хемилюминесценции и продукции ИЛ-8 лейкоцитами периферической крови больных ХВГС в ходе лечения Беталейкином.

 


* - различия с группой здоровых доноров достоверны, р<0,05

Терапия Беталейкином не приводила к существенным изменениям уровней провоспалительных цитокинов и рецепторного антагониста ИЛ-1 в циркуляции, что свидетельствует об отсутствии проявлений системного воспалительного ответа при введении в организм использованных для лечения доз. Однако в то же время к концу курса терапии Беталейкином произошло достоверное увеличение содержания интерферона альфа в сыворотках крови больных (табл.4). Можно предположить, что это изменение связано с индукцией синтеза эндогенного интерферона альфа под действием препарата и может являться одним из механизмов его противовирусного действия.

Таблица 4. Изменения уровней цитокинов в сыворотке периферической крови больных ХВГС в ходе лечения Беталейкином.

 


* - различия с группой здоровых доноров достоверны, р<0,05

Таким образом, анализируя полученные результаты в целом можно сделать следующие выводы: Беталейкин способствует снижению репликативной активности HCV, о чем свидетельствует уменьшение уровня РНК HCV в сыворотке крови. Эффективность 20 дневного курса терапии Беталейкином по своим результатам сравнима с 6 месячным курсом терапии Интералем при определении УВО через год после окончания лечения. Беталейкин оказывает более выраженное влияние по сравнению с Интералем на внепеченочную репликацию вируса в лимфоцитах.
Колебания показателей определения РНК HCV возможно можно объяснить следующим фактом. Известно, что в организме пациента HCV может циркулировать в виде нескольких квази-видов, имеющих мажорный и/или минорный вариант репликации. Минорные варианты вирусов обладают более выраженным тропизмом к клеткам крови [5].  Уровень образующейся РНК HCV при таком варианте репликации весьма низкий [6] и не определяется имеющимися тест системами. Возможно, Беталейкин, активируя лимфоциты, способствует переходу HCV из минорного варианта в мажорный вариант репликации, что выражается в повышении уровня РНК HCV в сыворотке крови. Вероятно также, что противовирусной эффект Беталейкина в большей степени проявляется при взаимодействии его с активно реплицирующими формами вируса, так как известно, что минорное состояние HCV является той формой существования вируса, которая позволяет «уходить» ему от иммунного контроля макроорганизма и возможно от действия лекарственных средств.
По-видимому механизм лечебного действия Беталейкина может иметь 3 составляющих:
1. Известно, что ИЛ-1 бета обладает прямым противовирусным действием в отношении HCV, отличающемся по путям реализации от действия интерферона альфа [6].
2. Беталейкин вызывает индукцию синтеза эндогенного интерферона альфа, противовирусного медиатора, способного усилить противовирусное действие.
3. Беталейкин обладает широким спектром иммуностимулирующего действия, что подтверждено и в настоящем исследовании у больных, получавших терапию Беталейкином. Стимуляция различных сторон врожденного и приобретенного противовирусного иммунитета может быть важной составляющей общего противовирусного действия препарата.
 Вероятно, целесообразно проводить повторный курс терапии Беталейкином через три месяца после окончания лечения, так как снижение показателей противовирусной эффективности препарата наблюдается в эти сроки. Оптимизация схемы назначения препарата может привести к еще более лучшим результатам лечения больных ХГС.

Литература

1. Dillon J. Hepatitis C: What is the best treatment? // J.Viral Hepat.-2004.-V.11.-Suppl.1.-P.23-27
2. Dinarello CA. Role of interleukin-1 in infectious diseases // Immunol.Rev.-1992.-V.127.-P.119-46
3. Zhu H., Liu C. Interleukin-1 inhibits hepatitis C virus subgenomic RNA replication by activation of extracellular regulated kinase pathway // J.Virology.-2003.-V.77.-P.5493-5498
4. Neumann A., Lam N., Dahari H. et al. Hepatitis C viral dynamics in vivo and the antiviral efficacy of interferon-alpha therapy // Science.-1998.-V.282.-P.103-107
5. Caussin-Schwemiling C., Schmit C., Stoll-Killer F. Study of the infection of human blood derived monocyte/macrophages with hepatitis C virus in vitro // J.Med.Virol.-2001.-V.65.-P.14-22
6. Boisvet J., He X., Cheung R. et al. Quantitative analysis of hepatitis C virus in peripheral blood and liver: replication detected only in liver // J.Infect.Dis.-2001.-V.184.-P.827-835

Резюме

Современная противовирусная терапия хронического гепатита С (ХГС)  для большинства пациентов в РФ нуждающихся в лечении является дорогостоящей и мало доступной. Поэтому изучение новых более доступных и дешевых средств противовирусной терапии ХГС  весьма актуально. Исходя из концепции о роли недостаточности клеточного иммунного ответа в персистенции вируса гепатита С, одним из препаратов который может быть использован в терапии ХГС является Беталейкин. При назначении Беталейкина в дозе 8 нг/кг массы в сутки, внутривенно капельно на 500 мл 5% глюкозы, через день в течение 20 дней у  28 (90,3%) пациентов через 12 месяцев после окончания терапии был отмечен положительный вирусологический ответ по сыворотке крови, при этом у 23 (74,2%) больных наблюдалось снижение вирусной нагрузки более чем на 2 log, а у 4 (12,9%) пациентов ПЦР на РНК ВГС в сыворотке крови была отрицательной. Целесообразно проведение повторного курса терапии Беталейкином через три месяца после окончания лечения, так как в эти сроки наблюдается снижение показателей противовирусной эффективности препарата.