Иммуногенетические особенности продукции интерлейкина-1β при затяжной и хронической (рецидивирующей) форме бактериального воспаления верхних дыхательных путей (гнойного риносинусита)

 

Л.Ф.Азнабаева,3, Э.Р.Шарипова, Н.А.Арефьева
Башкирский государственный медицинский университет
А.Г.Зайнуллина
Институт биохимии и генетики УфНЦ РАН
А.С.Симбирцев
ГосНИИ особочистых биопрепаратов, СПб.

Резюме

У 62 пациентов с гнойным риносинуситом (ГРС) затяжного и рецидивирующего течения анализировали распределение аллельных вариантов гена интерлейкина-1β (IL-1β) и взаимосвязи между их присутствием, уровнями продукции эндогенного IL-1β  и склонности к рецидивированию заболевания. Полиморфизм гена тестировали методами ПЦР и ПДРФ-ПЦР, способность к продукции IL-1β определяли при стимуляции фитогемагглютинином клеток крови, количественный анализ выявления цитокина в супернатантах клеточных культур проводили методом иммуноферментного анализа. У большинства (более 70%) больных ГРС отмечалась недостаточная продукция эндогенного IL-1β вне зависимости от склонности к рецидивированию заболевания. Установлено, что у больных ГРС гомозиготный низкопродуцирующий вариант гена  IL-1β (+3953) выявлялся в 2 раза чаще по сравнению с практически здоровыми лицами (82 человека). Определено увеличение фактора риска (OR=3,4) формирования рецидивирования заболевания при выявляемости гомозиготного низкопродуцирующего генотипа *С/*С локуса +3953 гена  IL-1β. В группе больных с затяжным течением, но без рецидивов заболевания имело место лишь тенденция к увеличению показателя. Выявлена ассоциация низкой продукции эндогенного IL-1β с гомозиготным вариантом гена  IL-1β - *С/*С локуса +3953 (OR=3,4), а высокой продукции – с гетерозиготным - *С/*Т (OR=7,6). Диагностическим маркером риска развития рецидивов заболевания является низкая продукция IL-1β, обусловленная носительством гомозиготного варианта гена  IL-1β - *С/*С локуса +3953. Патогенетически обусловленная терапия ГРС с затяжным и рецидивирующим течением рекомбинантным IL-1β (Беталейкином, СПб ГосНИИОЧБ) является высокоэффективной, сокращая количество рецидивов заболевания.
Риносинуситы - воспалительные заболевания околоносовых пазух и носа относятся к патологии верхних дыхательных путей и наиболее распространены в оториноларингологической практике [5,11]. Среди госпитализированных в ЛОР- отделения доля больных риносинуситом составляет от 29 до 60 % [2,3,15]. Несмотря на совершенствование способов диагностики и терапии гнойных риносинуситов, уровень их распространенности не уменьшается, более того, отмечается постоянное увеличение хронических форм заболевания [8,10].
В настоящее время воспалительные заболевания ЛОР - органов длительного и резистентного к терапии течения, в том числе синуситы, относят к  проявлениям инфекционного синдрома, обусловленного иммунодефицитом [4], в основе которого лежат нарушения кинетики иммунного ответа [9,13]. Важнейшая роль в обеспечении функционирования иммунной системы отводится межклеточным иммуномедиаторам (цитокинам), которые способствуют взаимодействию иммунокомпетентных клеток между собой и с другими клетками организма на различных этапах иммунного ответа. Одним из необходимых цитокинов для такого взаимодействия является интерлейкин-1, который синтезируется одним из первых в ответ на воздействие патогена [12]. Широко применяемые в клинической практике оториноларингологов препараты бактериальных лизатов реализуют свой иммунотропный эффект через способность стимулировать продукцию IL-1 [16]. Однако в условиях отсутствия активации продукции цитокина в ответ на воздействие бактериальных антигенов развивается толерантность [14], что клинически проявляется неудовлетворительными результатами лечения.
В настоящее время установлено, что гнойные риносинуситы с затяжным и хроническим течением в большинстве случаев сопровождаются недостаточностью продукции интерлейкина-1β на системном уровне [1], причины развития которой практически не изучены.
Одним из механизмов регулирования продукции цитокинов является контроль на генном уровне. Имеются гены, ответственные за продукцию цитокинов, например, кластер гена IL-1β находится на хромосоме 2q13-2q21 и имеет несколько полиморфных локусов. Полиморфизм локусов проявляется заменой одного нуклеотида на другой (например, в локусе +3953 С на Т) и реализуется в появлении как минимум трех генотипов данного локуса, а именно *C/*C, *C/*T и *T/*T.  Генотип  *C/*C характеризуется низкой, тогда как  *T/*T  - высокой продукцией цитокина [6]. В настоящее время остаются открытыми вопросы роли иммуногенетических особенностей в хронизации гнойного риносинусита.
В связи с этим целью настоящей работы стало определение влияния иммуногенетических особенностей продукции интерлейкина-1β на иммунопатогенез локального гнойного воспаления слизистых верхних дыхательных путей (рецидивирующий гнойный риносинусит). При этом исследована взаимосвязь выявленных особенностей с формированием затяжного течения и рецидивированием заболевания, а также с эффективностью лечения рекомбинантным ИЛ-1 бета.

Материалы и методы

Под наблюдением находились 62 больных гнойным риносинуситом, получавших лечение в ЛОР-отделении РКБ им. Г.Г.Куватова в период с 1998-2000г.г. У всех больных отмечалось нетипичное течение заболевания (длительность более 1 месяца) и устойчивость к традиционным методам лечения. Из них 31 пациент имели затяжное течение заболевания (более 1 месяца) без рецидивов и 31 – с рецидивирующим (обострения не менее 1 раз в год).  Из них 23 больных получали традиционное лечение и 28 пациентов, наряду с общепринятым лечением, получали рекомбинантный интерлейкин-1β (Беталейкин, СПб, ГосНИИОЧБ), который вводили внутривенно, медленно, капельно, разведенным физиологическим раствором из расчета 5 нг/кг веса больного ежедневно в течение пяти дней. Предварительно у всех обследуемых больных была дренирована воспаленная пазуха.
Всем больным проводилось клиническое и лабораторное обследование. Изучались характер заболевания на момент поступления и в отдаленные сроки через 1 и 5 лет. Проводился осмотр ЛОР-органов, в том числе эндоскопия полости носа гибким эндоскопом «Olympus».  С целью выявления анатомических особенностей выполнялась рентгенография или компьютерная томография. Больные с анатомической патологией, нарушающей функцию околоносовых пазух, из исследования исключались. Лабораторное обследование состояло в определении продукции эндогенного  интерлейкина-1β клетками крови при стимуляции фитогемагглютинином. Для количественного выявления цитокина в супернатантах клеточных культур использовали метод иммуноферментного анализа  (тест-наборы ООО «Цитокин», СПб). Всем больным проводилось молекулярно-генетическое исследование. Методом полимеразно-цепной реакции определяли 2 полиморфных локуса гена IL-1β: -511C>T и +3953С>T с использованием специфических олигонуклеотидных праймеров («Силекс», Москва). Нуклеотидные замены определяли после гидролиза амплифицированных фрагментов ДНК соответствующей рестриктазой (Ama87I и TaqI, «СибЭнзим», Новосибирск)[17]. Разделение фрагментов ДНК после амплификации и рестрикции проводили электрофорезом в 7% полиакриламидном геле. Полученные результаты сопоставляли  с данными 82 практически здоровых лиц. Оценка силы ассоциаций генотипа с продукцией IL-1β и риском формирования хронического гнойного воспаления проводилась с использованием показателя соотношения шансов (odds ratio, OR) по формуле OR=(a*d)/(b*c). При OR более 1 ассоциацию расценивали как положительную (фактор риска). При OR менее 1 – как отрицательную (фактор устойчивости) [18].

Результаты и обсуждение

Результаты исследования способности клеток крови больных гнойными формами риносинусита к продукции эндогенного IL-1β показали большой разброс значений - от 156 пг/мл до 2680 пг/мл, что свидетельствовало о различном функциональном состоянии иммунной системы  в виде угнетения, отсутствия активации, либо активации. Соответственно этому  все больные были разделены на 3 группы. В основе создания групп лежала формула, позволяющая оценить степень отклонения показателя больного от среднеарифметического значения показателя в группе практически здоровых лиц (M) [7].
I группу (31%) составили больные, у которых показатели, отличались от значений М  на 33-66% в меньшую сторону (менее 340,58 пг/мл) и соответствовали II степени отклонений, требуя специального отношения (II степень недостаточности). II группу (39%) – больные, у которых показатели не отличались от данных ПЗЛ и находились в пределах от 340,58 пг/мл до 676,08 пг/мл. III группу (30%) больных составили пациенты, у которых показатели отличались в большую сторону от значений М  на 33-66% (в пределах от 676,08 пг/мл до 843,83 пг/мл) (II и III степень гиперпродукции цитокина).
Известно, что для адекватного воспаления требуется активация сети провоспалительных факторов, поэтому отсутствие увеличения продукции одного из основных провоспалительных цитокинов у лиц I и II групп рассматривали как недостаточность продукции IL-1β. Сопоставление результатов продукции цитокина с данными иммунограмм подтвердило высказанное предположение. Так, у лиц I и II групп были выявлены сниженные показатели практически во всех звеньях иммунной системы, более выраженная у больных со сниженной продукцией IL-1β. В обеих группах была выявлена Т-клеточная недостаточность и низкая способность нейтрофилов очага воспаления к адгезии. Тогда как у больных III группы изменения были минимальными и касались преимущественно метаболических свойств нейтрофилов [1]. Таким образом, у 70% пациентов гнойным риносинуситом отмечалась неадекватная воспалению продукция эндогенного IL-1β, что реализовалось в недостаточности иммунного реагирования.
Оценка частоты выявляемости недостаточной продукции цитокина (IL-1β)  в зависимости от клинического течения заболевания свидетельствовала об отсутствии выраженных отличий в исследуемых группах (рис.1).

Рис.1 Частота выявляемости неадекватной продукции IL-1β у больных гнойным риносинуситом в зависимости от наличия рецидивирования заболевания (%).
Как видно из рисунка, недостаточность продукции эндогенного IL-1β выявлялась одинаково часто в обеих группах (соответственно 76% и 78%). Полученные результаты свидетельствуют о наличии недостаточности цитокинового реагирования у большинства больных с нетипичным клиническим течением, вне зависимости от наличия рецидивирования заболевания.
Для определения возможной роли генетической предрасположенности к развитию нетипичного клинического течения заболевания и его рецидивирования было проведено молекулярно- генетическое исследование двух  известных полиморфных локусов гена IL-1β: - 511C>T и +3953С>T. Анализ распределения частот различных генотипов показал наличие ассоциации заболевания только с полиморфизмом локуса +3953С>T. Полученные данные представлены в табл.1.                                                                                                                     

Таблица 1. Распределение генотипов полиморфных локусов гена IL-1β:- 511C>T и +3953С>T у практически здоровых лиц и больных гнойным риносинуситом (%).

Примечание: показатели отличаются от данных практически здоровых лиц (χ2=4,29, P=0,039, OR=2,16).
Как видно из данных таблицы, среди больных с нетипичным течением гнойного риносинусита достоверно чаще выявляется низкопродуцирующий генотип *С/*С локуса +3953C>T гена IL-1β. Однако при проведении анализа ассоциаций генотипа с клиническими особенностями течения заболевания было установлено, что низкопродуцирующий генотип достоверно часто выявлялся только в группе больных с рецидивирующим течением (χ2=6,2, P=0,013, OR=3,4)(рис.2).

Рис.2 Частота выявляемости низкопродуцирующего генотипа *С/*С локуса +3953C>T гена IL-1β у больных гнойным риносинуситом в зависимости от наличия рецидивирования заболевания (%).

Как видно из рисунка, в группе с затяжным течением без рецидивирования заболевания отмечалась лишь тенденция к увеличению показателя (58% против 46%; χ2=0,92, P=0,33, OR=1,64).
Оценка корреляционной зависимости показателей продукции IL-1β  и типа генотипа не выявила прямой зависимости. Однако проведение анализа ассоциации низкопродуцирующего генотипа *С/*С локуса +3953C>T гена IL-1β у больных гнойным риносинуситом  с низкой продукцией IL-1β показал, что генотип *С/*С выявлялся значительно чаще по сравнению с группой больных с высокой продукцией цитокина и практически здоровыми лицами (соответственно 74% против 38% и 46%; χ2=5,46, P=0,02, OR=3,4 и χ2=6,2, P=0,013, OR=3,4) (рис.3).  

Рис.3 Выявляемость различных полиморфных генотипов локуса +3953C>T гена IL-1β у больных гнойным риносинуситом  в зависимости от способности к продукции IL-1β.

Следовательно, низкая продукция цитокина ассоциирована с низкопродуцирующим генотипом *С/*С локуса +3953C>T гена IL-1β. Высокая продукция IL-1β  была ассоциирована с генотипом *С/*Т (χ2=6,06, P=0,01, OR=7,6), но не с высокопродуцирующим генотипом *Т/*Т. В целом вариант *Т/*Т  как среди больных ГРС, так и практически здоровых лиц встречался редко (около 12%). Полученные данные позволяют высказать предположение, что при локальном гнойном воспалении слизистых верхних дыхательных путей адекватная продукция IL-1β  ассоциирована с генотипом *С/*Т.
Включение в лечение больных ГРС со склонностью к хронизации воспалительного процесса рекомбинантного интерлейкина-1β показало высокую клиническую эффективность. Непосредственно после лечения практически у всех отмечалось завершение воспалительного процесса. При этом у половины больных клиническое выздоровление наступало на 3-4 сутки лечения. Тогда как при традиционных методах терапии в эти сроки наблюдалось только начало улучшения состояния больных.  Более  того, в 20% случаев лечение практически не имели положительной динамики.
Оценка отдаленных результатов лечения показало преимущество заместительной цитокинотерапии (рис.4).

Рис.4 Рецидивирование гнойного риносинусита в зависимости от проведенного лечения.

Как видно из рисунка, включение в схему лечения рекомбинантного интерлейкина-1β способствовало сокращению рецидивов заболевания (21% против 46%). Отмечено, что среди рецидивирующих больных у большинства (61%) имелась генетически обусловленная недостаточность продукции IL-1β.
Таким образом, установлены клинические особенности течения гнойного риносинусита – недостаточная продукция провоспалительного цитокина интерлейкина-1β спо-собствует формированию затяжного и рецидивирующего течения заболевания. Выявлена генетическая обусловленность рецидивирующего течения гнойного риносинусита, связанная с полиморфизмом локуса +3953 C>T гена IL-1β. Диагностическим маркером риска развития рецидивирующего течения заболевания является сочетание низких значений продукции интерлейкина-1β и выявление низкопродуцирующего гомозиготного варианта *C/*C гена IL-1β (+3953). Лечение больных гнойным риносинуситом с затяжным и хроническим течением рекомбинантным интерлейкином-1β является патогенетически обусловленным, способствует повышению клинической эффективности проводимой терапии и сокращению рецидивов.

 Список литературы:

1. Азнабаева Л.Ф. Провоспалительные цитокины в иммунопатогенезе и лечении хронических гнойных риносинуситов: Автореф. дис. ... д - ра  мед. наук. -  СПб., 2002. - 37 с.
2. Арефьева Н.А., Абдурашитов Р.Ш., Янборисов Т.М., Шарипов Р.А..Риногенный синусит: Методические рекомендации - Уфа, 1997. - 19 с.
3. Гофман В.Р., Смирнов В.С. Состояние иммунной системы при острых и хронических заболеваниях ЛОР - органов //  Иммунодефицитные состояния / Под ред. В.С. Смирнова и И.С. Фрейдлин. - СПб., 2000. - С.163 - 187.
4. Гришина  Т.И., Пухальский А.Л. Основы иммунодиагностики // Клиническая иммунология: Руководство для врачей / Под ред. Е.И. Соколова. - М.: Медицина, 1998. -   С.57-78.
5. Егорова В.Н., Плужников М.С., Лавренева Г.В. и др. Монотерапия острых гнойных синуситов при местном применении Ронколейкина - рекомбинантного интерлейкина-2 человека // Terra Medica nova. - 2000. - №1(17). - С. 29 - 31.
6. Коненков В.И., Смольникова М.И. Структурные основы и функциональная значимость аллельного полиморфизма генов цитокинов человека и их рецепторов // Медицинская иммунология. – 2003. – Т.5, №1-2. – С. 11-28.
7. Лившиц В.М. Медицинские лабораторные анализы: Справочник / В.М.Лившиц, В.И. Сидельникова. - М.: Триада-Х, 2000. - С.137.
8. Лопатин А.С. Минимально инвазивная эндоскопическая хирургия заболеваний полости  носа, околоносовых пазух и носоглотки: Автореф. дис. ... д - ра  мед. наук. -  Л., 1998. - 42 с.
9. Нестерова И.В. Программа иммунореабилитации больных вторичными иммунодефицитами // Int. J. on Immunorehabilitation. - 1998. - № 9 . - Р. 40 - 45.
10. Пискунов С.З., Пискунов Г.З. Диагностика и лечение воспалительных процессов слизистой оболочки носа и околоносовых пазух: Воронеж: Изд-во ВГУ, 1991. - 184 с.
11. Плужников М.С., Лавренева Г.В., Галкина О.В. и др.Местное применение роколейкина при острых гнойных риносинуситах // Медицинская иммунология.- 1999. - Т. 1,  № 3 - 4. - С. 128.
12. Симбирцев А.С. Интерлейкин-1. Биологические свойства и перспективы применения в клинике // Новости оториноларингологии и логопатологии. - 1997. - № 4 (12). - С.10 - 16.
13. Фрейдлин И.С. Кинетика воспаления и иммунного ответа // Медицинская иммунология.- 1999. - Т. 1, № 3 - 4. - С. 25 - 26.
14. Фрейдлин И.С. Цитокины в клинике // Современные проблемы аллергологии, клинической иммунологии и иммунофармакологии: Сборник трудов 2-го Нац. Кон-гресса РААКИ. - М., 1998. - С. 104 - 112.
15. Шеврыгин Б.В. Синусит у детей и взрослых. -  М.: Медицина, 1998. - 256с.
16. Guenounon M., Vacheron F., Nauciel C. Interleukin-1, a mediator of immunoadjuvant peptidoglycans  // Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. - 1985. - Vol. 8. - № 3 - 4. - Р. 273 - 284.
17. Santtila S., Savinainen K., Hurme M. et al. Presence of the IL-1RA allele 2 (IL-1RN*2) is Associated with enhanced IL-1β Production in vitro // Scan. J. Immunology. – 1998. – Vol. 47. – P. 195 – 198.
18. Schlesselman J. Case-control studies. Design, conduct, analysis. // New York, Oxford: Oxford University Prss. – 1982. – P.58-96.